Den, kdy zemřela virologie – Autor: Jamie Andrews
16. února 2016 – Virus podroben soudnímu procesu
Přeložil: Vladimír Bartoš
Úvod
Pravděpodobně jednou z nejlepších událostí na téma neexistence virů v nedávné historii byl soudní spor mezi Dr. Stefanem Lankou a Dr. Davidem Bardensem. Jamie si dal značnou práci, aby soudní jednání prohrabal a přeložil ve vlákně na Twitteru, které si můžete prohlédnout zde.
24. listopadu 2011 nabídl německý virolog Dr. Stefan Lanka cenu 100 tisíc eur za vědeckou publikaci, v níž bude prokázána údajná existence „viru spalniček“. Učinil tak proto, aby upozornil na podle něj podvodnou vědu, která stojí za povinným očkováním proti spalničkám.
Tuto výzvu přijal Dr. David Bardens, který předložil 6 prací, jež podle něj dokazují existenci viru spalniček a podal žalobu k zemskému soudu v Ravensburgu pro neplacení. Soudce Schneider vydal 12. března 2015 rozsudek ad hoc ještě před jakýmkoli vyvrácením ze strany Dr. Lanky.
Pokud si tento soudní případ vyhledáte, obvykle se ve výsledcích vyhledávání setkáte s tímto. Hromady článků, které ukazují, že Dr. Lanka prohrál kvůli tomuto prvnímu soudnímu rozhodnutí, ale nic nemůže být dále od pravdy.
Soudní případ Lanka – část 1
Tento rozsudek ad hoc nařizuje Dr. Lankovi vyplatit Bardensovi peněžitou odměnu. Lanka se proti tomuto rozhodnutí odvolal a to se dostalo k Vyššímu zemskému soudu ve Stuttgartu, kde nechali Lanku předložit vědecké vyvrácení.
Online soudní záznamy si můžete prohlédnout na níže uvedeném odkazu:
Soud jmenoval znalce profesora Andrease Podbielského, aby jménem Bardense přednesl případ z vědeckého hlediska.
Byl bakteriologem bez praktických nebo publikovaných znalostí v oblasti virologie. Jeho křížový výslech je zaznamenán v protokolu u soudu v Ravensburgu.
Je napsán v němčině a byla použita překladatelská aplikace, pokud by němčináři mohli překlad ověřit, velmi by to pomohlo. Důležitá slova jsou jednoznačná, ale jen pro pořádek uvádím, že se jedná o přeloženou verzi (všechny citace textu v částech případu Lanka jsou překlady ze soudního spisu).
Šest zásadních prací, které Dr. David Bardens uvedl jako tvrdé konkrétní důkazy, že virus spalniček je příčinou, jsou tyto:
- Enders JF, Peebles TC. Propagace cytopatogenních agens z pacientů se spalničkami v tkáňových kulturách. Proc Soc Exp Biol Med. 1954 Jun;86(2):277-286.
- Bech V, Magnus Pv. Studies on measles virus in monkey kidney tissue cultures [Studie viru spalniček v tkáňových kulturách opičích ledvin]. Acta Pathol Microbiol Scand. 1959; 42(1): 75-85
- Horikami SM, Moyer SA. Structure, Transcription, and Replication of measles Virus [Struktura, transkripce a replikace viru spalniček]. Curr Top Microbiol Immunol. 1995; 191: 35-50.
- Nakai M, Imagawa DT. Electron microscopy of measels virus replication [Elektronová mikroskopie replikace viru spalniček]. J Virol. 1969 Feb; 3(2): 187-97.
- Lund GA, Tyrell, DL, Bradley RD, Scraba DG. The molecular length of measles virus RNA and the structural organization of measles nucleocapsids (Molekulární délka RNA viru spalniček a strukturální uspořádání nukleokapsid). J Gen Virol. 1984 Sep;65 (Pt 9):1535-42.
- Daikoku E, Morita C, Kohno T, Sano K. Analysis of Morphology and Infectivity of measles Virus Particles. Bulletin of the Osaka Medical College. 2007; 53(2): 107-14.
V soudním řízení se hodně zaměřují na zkoumání jedné konkrétní práce Johna Enderse z roku 1954. Tzv. izolace viru spalniček, která byla shodou okolností prvním případem, kdy byla použita technika izolace na buněčných kulturách a která se dodnes používá pro každou izolaci viru ve virologii.
Vysvětlete: Tento příspěvek Enderse ^~^ Peeblese z roku 1954 rozhodně splňuje postuláty Henle-Kochových tříd formulací č. 1 a 2. Je zde dokonce uvedena určitá biochemická charakteristika (teplotní citlivost) a konstatování velikosti. V příspěvku Becha ^~^ z Magnus 1958 je splněn i třetí klasický Henle-Kochův postulát. V tomto příspěvku jsme dodatečně demonstrovali obrannou reakci, která je relevantní v rozšířené verzi těchto postulátů, jak je uvedeno. Ve skutečnosti však experiment ve smyslu 4. klasicky formulovaného Henle-Kochova postulátu tehdy proveden nebyl. Pokud jde o další tři původní práce, ty se významně zabývají velikostí a elektron-mikroskopickým zobrazením viru spalniček a do jisté míry z tohoto přehledu vypadávají. V přehledovém článku z roku 1995 je pak citováno a prezentováno několik článků, které s ohledem na virus spalniček splňují všechny postuláty č. 1 a 2. 1 až 4 ve formulaci classis.
Při křížovém zkoumání tohoto článku se Podbielski dopouští 2 zásadních přiznání:
1. Tento článek nemá „žádnou negativní kontrolu“:
Strana 7: Nedokážu nyní říci, zda existuje článek, který komplexně prezentuje totéž, co zmíněné původní články, aniž by ukázal jejich metodologické nedostatky, například s negativními kontrolami, které ve skutečnosti chybí. V této souvislosti bych chtěl znovu upozornit, že určité části experimentálního uspořádání v původních článcích z let ’54 a ’58 mají určitou kontrolní funkci. Jako rozhodující se mi jeví následující: Takové vědecké články jsou využívány pro následné práce jiných vědců.
2. Nesplňuje Kochovy postuláty, což jsou vědecká kritéria stanovená pro důkaz existence patogenu.
Strana 8: Když posuzovatel Schreiner sledoval, zda tato okolnost snižuje důkazní hodnotu: Ne, vzhledem k tomu, že biologický výzkum probíhá již mnoho desetiletí, tomu tak není. Na dotaz posuzovatele Schreinera, zda kritika raných původních prací, například že práce z roku 1954 nesplňuje Henle-Kochův postulát 3., nevede k tomu, že tato práce je nepoužitelná, nebo zda lze na takové práci vůbec něco založit: Není úkolem odborných článků o mikrobiologických otázkách, aby každý odborný článek vzatý sám o sobě obsahoval hned všechny čtyři tyto Henle-Kochovy postuláty Splňuje; jak vidíme, některé články se jimi vůbec nezabývají. Každý článek má svůj vlastní rozsah a pracovní náplň. Pokud byste chtěli v jednom článku komplexně splnit požadavky všech čtyř Henle-Kochových postulátů, byl by článek pravděpodobně tak obsáhlý, že by s ohledem na zadání redakce možná ani nebyl vhodný k publikaci.
Podbielski se snaží nedostatek kontroly v článku zakrýt tím, že se jedná o „starý článek“, na kterém se dá stavět. To je zásadní problém, jak se brzy přesvědčíte. Snaží se také zamlčet skutečnost, že nesplňuje Kochovy postuláty a v ohromujícím přiznání žádný nesplní.
Opravdu neznám jedinou práci, která by sama o sobě splňovala všechny čtyři postuláty.
Zároveň pokládá základy toho, co používají ti, kdo chtějí o tomto procesu lhát; že by „mohli“ splnit Kochovy postuláty, ale musela by to být velmi velmi dlouhá práce. To je pouze vymyšlená “vata” ve snaze zastřít nulové důkazy, které měl a se kterými soudci souhlasili.
Každý článek má svůj vlastní rozsah a obsah práce. Pokud byste chtěli komplexně splnit požadavky všech čtyř Henle-Kochových postulátů v jednom článku, byl by článek pravděpodobně tak dlouhý, že by vzhledem k zadání redakce možná ani nebyl vhodný k publikaci. Samo o sobě to není žádný nedostatek.
Pro zajímavost, tento proces nepostrádal komediální nádech, neboť zde vidíme, jak se „odborník“ Podbielski střetává s Dr. Mankertzem z Institutu Roberta Kocha a neshodnou se mezi sebou na tom, zda by virus „měl“ obsahovat ribozom, či nikoliv!
Na otázku posuzovatele Schreinera, jaké jsou složky viru spalniček, zejména zda virus spalniček obsahuje ribozomy: Ne, virus spalniček žádné ribonomy neobsahuje. Běžná definice viru je, že nemá žádné ribozomy. Posudkový komisař Schreiner se dále zabývá žalovaným tvrzenou zprávou Institutu Roberta Kocha, podle níž virus spalniček obsahuje ribozomy: na jeho dotaz, zda by takové tvrzení hodilo celý pojem viru spalniček takříkajíc přes palubu: Takové prohlášení by bylo skutečně nesmírně překvapivé, vzbudilo by největší pozornost vědecké komunity a mohlo by být publikováno s vyhlídkou na velký účinek.
Prof. Annette Mankertzová – vedoucí oddělení v Institutu Roberta Kocha
Přesuneme se tedy k řízení u Vyššího zemského soudu ve Stuttgartu, kde Dr. Lanka předložil své 58 stránkové vědecké vyvrácení. Následuje hlavní princip tohoto vyvrácení.
Důvodem, proč se soudní řízení silně zaměřuje na Endersovu práci z roku 1954, je skutečnost, že se jedná o údajný důkaz izolace viru. Všechny ostatní předložené práce, jako je sekvenování genomu, EM, analýza proteinů, PCR atd. musí mít jako referenci izolovaný virus, bez něhož je nelze považovat za důkaz.
Vrátíme-li se ke komentáři Podbielského o „chybějící negativní kontrole“. To byla skutečně jen poloviční pravda. Kontrola „nechyběla“, ale kategoricky selhala. Účinky, které měly označovat přítomnost viru, byly zjištěny i v neinfikovaném vzorku. Část v článku Enders, 1954 je uvedena níže a vlákno na Twitteru vysvětlující výsledky kontroly si můžete prohlédnout zde.
Vysvětlení neúspěšné kontroly Enderse z roku 1954 je následující (pro ty, kteří ji neznají):
- Enders 1954 Control Test – The End of Germ Theory
- Virus “’Isolation“‘ blown out of the water in under 4mins – Part 1
- Thomas Cowan – How They „Isolate“ A Virus
- Greatest Joke in Viroliegy – Exosomes = Extracellular Vesicle = Cellular Fragments = Viruses
Lidé (prolhaní šašci), kteří podporují bilionovou farmaceutickou genocidní mašinérii, nyní rádi omílají druhou část, která zní „po fixaci a obarvení je bylo možné rozlišit“, jako by to znamenalo „fajn, to je úspěšná kontrola“. Je třeba vzít v úvahu následující:
- Změna (CPE), která má znamenat přítomnost viru, pokud se vůbec v kontrole najde, je neúspěšný pokus. Rozlišení není popsáno a je irelevantní.
- U soudu byla popsána jako chybějící, tj. neúplná.
Podbielski také navrhl, že Endersova publikace je „stará“ a že je třeba na ni navázat, a předpokládá, že se tak stalo.
Rád bych znovu upozornil, že určité části experimentálního uspořádání v původních článcích z let 54 a 58 mají určitou kontrolní funkci. Rozhodující se mi zdá následující: Takové vědecké články jsou využívány pro následnou práci jiných vědců. V důsledku toho se v odborné literatuře vytvořil dobrý čisticí mechanismus, který v poslední době postihl i některé články z nejlépe hodnocených odborných časopisů. Pokud procesy prezentované v článku nelze reprodukovat v navazujících experimentech, obvykle to vyjde najevo v článcích jiných vědců. Přinejmenším se to dalo očekávat u tématu, které bylo předmětem tak intenzivního výzkumu, jako jsou spalničky.
Nyní to začíná být zajímavé, jak jsme si objasnili. Z právního hlediska tato technika buněčné kultury selhala. Bohužel pro virology a klub farmaceutické genocidy v hodnotě bilionu dolarů je tato technika buněčných kultur zlatým standardem každé izolace virů od roku 1954 do současnosti.
Opět si všimněte komentáře profesora Podbielského, že „to byla stará práce“, na které mohla věda stavět. No, pokud znáte závěry této studie (pozor, spoiler), všimnete si; Neexistují žádné vědecké dodatky s jakoukoli řádně provedenou negativní kontrolou. Vzhledem k tomu, že vědecký dokument právně vyžaduje, aby byly provedeny odpovídající kontroly, aby mohl být použit vládní politikou. V tomto případě u vakcíny proti spalničkám můžeme pouze konstatovat, že takový dokument neexistuje, a proto také docházíme k závěru, že neexistuje žádný důkaz existence jakéhokoli viru pomocí buněčné kultury.
Rychle tedy přejdeme k závěrečným výrokům jednomyslného rozhodnutí všech tří soudců Vyššího zemského soudu ve Stuttgartu, kterým bylo rozhodnutí zrušeno a žalobci Dr. Stefanu Lankovi byla přiznána výhra:
122″ V důsledku toho bylo odvolání v rozsahu, v jakém je přípustné, úspěšné, protože žalobcovo kritérium předložení důkazu o existenci viru spalniček prostřednictvím „vědecké publikace“ nebylo žalobcem splněno. Žalobce proto nemá nárok na odměnu advokáta před podáním žaloby.
123′ 1. Výrok o nákladech řízení se opírá o § 91, 92 odst. 2 č. 1 ZPO.
124′ 2. Rozhodnutí o předběžné vykonatelnosti se opírá o §§ 708 č. 10, 711 ZPO.
125′ 3. Revize se nepovoluje, protože nejsou splněny požadavky § 542 odst. 2 ZPO.
Dr. Bardens se pak mohl proti rozhodnutí odvolat v určité lhůtě k Nejvyššímu soudu SRN. Rozhodl se, že se proti rozhodnutí neodvolá, a lhůta pro podání odvolání uplynula.
Nyní se najde spousta hloupých tupců, kteří věří v bájné vzdušné víly a velkou farmacii natolik, že chtějí šířit kategorickou lež, že „Lanka vyhrál na základě formalit, protože řekl, že důkaz musí být pouze v 1 vědeckém článku“. Kategoricky vám ukážu, že je to lež. Ano, je tam uvedeno, že Lanka chtěl „jediný článek“, a ano, bylo tam uvedeno, že se požaduje přesné měření viru, tj. charakterizace izolované biologické částice. Nikoliv o kresbu, která je běžnou součástí splnění Kochových postulátů.
Důkaz jedinou vědeckou publikací 88 Peněžitá cena se podle jasného znění výzvy k předkládání prací 89 vyplácí, pokud je předložena vědecká publikace, v níž je existence viru spalniček nejen tvrzena, ale také prokázána a mimo jiné je určen jeho průměr. Peněžní cena nebude vyplacena, pokud bude určení průměru viru spalniček založeno pouze na modelech nebo nákresech, jako je tento.
Důvody, proč porotci akceptovali pouze jedinou práci, však byly založeny na racionální úvaze, nikoli na „formalitě“, že nechtěli, aby 100 malých písmen bylo „poskládáno jako puzzle“, protože to by nepředstavovalo důkaz. To by mělo být zřejmé…
92′ Pro takové chápání hovoří nejen formulace, ale také skutečnost, že jediná práce je nejen samostatná z hlediska své vnější formy, a tím jasně vymezuje vnitřně strukturovaný materiál, ale také že nemůže vzniknout spor o to, prostřednictvím které pasáže textu které z případně velkého počtu prací lze důkaz poskytnout. Při velkém počtu děl, která mají být z celkového pohledu použita jako důkaz, může být mnohem obtížnější uvést každé z děl na srovnatelnou a smysluplnou úroveň z hlediska metody a obsahu. Kromě toho se značně snižuje náročnost zkoušky, pokud má být důkaz poskytnut v díle podle znění. Je zřejmé, že žalovaný, který je rozpoznatelný i pro třetí osoby, si nemůže přát, aby bylo předloženo přibližně 50, 100 nebo 500 různých prací, z nichž se pak jednotlivé textové pasáže nebo úseky skládají jako puzzle. Důvody proveditelnosti a přiměřenosti hovořily ve prospěch chápání výzvy k podání nabídek tak, že jejich znění vypovídá v celkovém kontextu.
Objevuje se také výkřik, že „protože bylo předloženo více než jeden dokument, Lanka vyvázl“. To je rovněž zjevná lež, která je jasně vyřčena níže. Nebyl stanoven žádný limit pro počet příspěvků, které bylo možné předložit.
Konečně v textu výzvy nejsou uvedena žádná kritéria pro smysluplné omezení počtu prací, které lze předložit jako důkaz, a taková kritéria nejsou ani zřejmá: 95″ – Na rozdíl od krajského soudu – lze také….
Lanka se však dožadoval konkrétních věcí, jako je „velikost viru“. Je zřejmé, že pokud máte izolovanou částici, měli byste znát její přesnou velikost. Problém je, že profesor Podbieski při křížovém výslechu poznamenal, že „neví, ale všechny byly jiné“.
Na otázku posuzovatele Schreinera, jak velký je virus spalniček nyní: Strana 11″ Nemohu zpaměti uvést žádné číslo. Ve svém znaleckém posudku jsem již podrobněji vysvětlil, že a proč jsou informace o velikosti variabilní a lze je nalézt v diskutované literatuře.
Ale k tomu nejželeznějšímu a nevyvratitelnému kousku logiky, který vyhazuje z okna myšlenku o Lankově „štěstí“. Endersova izolační práce „měla“ stačit jako dostatečný důkaz existence viru spalniček. Jeden jediný dokument… Německý soudní systém s tím nesouhlasil.
Soudní případ Lanka – část 2
V první části jsme se dozvěděli, jak německý virolog Stefan Lanka vyhrál soudní spor, v němž prokázal, že neexistuje žádný důkaz o existenci viru spalniček. Ve skutečnosti dokázal, že žádný virus nebyl nikdy izolován, protože důvod, proč vyhrál, byl založen výhradně na nedostatku kontrol.
Metodu izolace údajného viru vymyslel v roce 1954 John Enders, který za ni získal Nobelovu cenu. Vzal kulturu opičích ledvinových buněk, antibiotika, fetální hovězí sérum a lidské vzorky, o nichž se předpokládalo, že obsahují virus. Poté tuto kulturu po několik dní vystavil stresu.
Když se ledvinové buňky rozpadly, čemuž se také říká „cytopatický efekt“ (CPE), ukázal na tuto kulturu a řekl: „Podívejte, to udělal virus“. Vědecky nebo logicky uvažující člověk se zeptá: Byl to určitě virus, kdo to udělal? Jak to můžete říct, vždyť jste jen předpokládali, že tam byl.
Je zapotřebí kontrola, která by prokázala, že CPE způsobuje nezávislá proměnná (virus) a ne směs dalších složek. Enders tedy vzal všechny tyto složky bez přidání „infikovaného vzorku“ a přesto výsledky ukázaly CPE, což znamená, že to nebylo něco v lidském vzorku, co způsobilo tento účinek.
Píše se tam, že vzorky byly poté rozlišitelné po „fixaci a obarvení“, ale pokud tvrdíte, že CPE znamená přítomnost viru a CPE se objevil, i když tam žádný virus být nemohl. Proto kontrola ukázala, že pokus je neplatný.
Bizarní však je, že místo toho, aby experiment zneplatnil, udělily mu vědecké síně Nobelovu cenu a začlenily jeho techniku do každého jednotlivého experimentu „izolujícího“ virus. Stejná technika se používá dodnes a je téměř totožná s protokolem WHO.
Pokud tedy vrátíme své myšlenky zpět k 1. části procesu, kde Podbielski naznačuje, že tato „stará“ technika byla pravděpodobně od té doby vystavěna. Jeho předpoklad byl zjevně mylný, protože nebyl schopen předložit jedinou práci s touto adekvátní kontrolou, která by ukazovala „něco“ patogenního.
Rád bych znovu upozornil, že určité části experimentálního uspořádání v původních článcích z let ’54 a ’58 mají určitou kontrolní funkci. Rozhodující se mi zdá následující: Takové vědecké články jsou využívány pro následnou práci jiných vědců. V důsledku toho se v odborné literatuře vytvořil dobrý čisticí mechanismus, který v poslední době postihl i některé články z nejlépe hodnocených odborných časopisů. Pokud procesy prezentované v článku nelze reprodukovat v navazujících experimentech, obvykle to vyjde najevo v článcích jiných vědců. Přinejmenším se to dalo očekávat u tématu, které bylo předmětem tak intenzivního výzkumu, jako jsou spalničky.
Stefan Lanka v rámci 58 stránkového vědeckého vyvrácení Endersova článku pověřil laboratoř provedením kontrolního experimentu, při němž použil protokoly a materiály WHO v základním testu. Zde je popis v soudních dokumentech a diapozitivy.
Pokus
Jménem Dr. Lanky jsme ověřovali, zda i jiná agens než údajný virus spalniček mohou vést ke splynutí buněk s následnou buněčnou smrtí (=tvorba syncytií) v buněčných kulturách, které vypadají přesně jako ve standardizovaném protokolu, který se na základě publikace Enderse a Peeblese z roku 1954 pro detekci viru spalniček“ stal celosvětově závazným. Pro tento účel byl striktně dodržen protokol Světové zdravotnické organizace (WHO) pro detekci infekce spalničkami v buněčných kulturách[21].
Byly použity buněčné linie Vero/CCL-81 a Vero/hSLAM. Buňky Vero byly izolovány v březnu 1962 Y. Kasumurou a Y. Kawakitou z ledvinových buněk afrických opic (Cercopithecusaethiops}. Patří mezi nejčastěji používané kontinuální buněčné linie savců ve výzkumu. Buňky Vero/hSLAM byly transfekovány vektorovým plazmidem pCxN2 od Dr. Vyvinul je Yusuke Yanagi. Vektorový plazmid pCxN2 má gen rezistenci vůči neomycinu a expresní plazmid (pCAG-hSLAM) kódující lidskou signální lymfocytární aktivační molekulu (hSLAM). Buněčná linie Vero/hSLAM je nyní doporučována pro rutinní „izolaci“ „viru spalniček“. Účastníci chápou izolaci jako vytvoření efektu syncytiální formace ve zkumavce, což je od roku 1954 ad hoc ztotožňováno s přítomností, množením a přenosem „viru“ z člověka do zkumavky, ačkoli izolace „viru spalniček“ ve významu…
(Celý kontrolní experiment k “viru spalniček”, který Dr. Lanka přiložil jako důkaz v procesu, najdete anglicky zde, pozn. překl)
Lankův nejnovější kontrolní test
Přestože Lanka případ vyhrál a u soudu již prokázal, že proces izolace byl podvodný, provedl i další kontrolní pokus. Tentokrát mnohem komplexnější, aby rozptýlil veškeré pochybnosti. Tato práce byla zveřejněna 10. března 2022 a studie je rozebrána níže.
Úvod
Viry z izolátů, např. z netopýrů, se množí v buněčných kulturách za náročných kultivačních podmínek tak, že se jim sníží množství fetálního telecího séra (FCS) z 10 % na 2 % nebo 1 % v Dulbeccově modifikovaném Eaglově médiu (DMEM) se zbaví velké části stravy, což odpovídá doporučením ATCC. Deprivace potravy se také rutinně kombinuje s vysokými koncentracemi trojitých antibiotik Gibco (antibiotika penicilin/streptomycin s antimykotikem amfotericinem B) a postupným slepým pasážováním supernatantů buněčných kultur do další buněčné kultury[22].
Z morfologického hlediska vede amplifikace virionů k cytopatickým účinkům (CPE), které mají za následek zakulacení buněk, tvorbu balónků a buněčnou degeneraci, což se nakonec projeví tvorbou plaků v konfluentní buněčné kultuře. V souladu s tím lze virové částice obohacené z těchto supernatantů buněčných kultur zobrazit pomocí elektronové mikroskopie. Abychom vyloučili hypotézu, že drsné stresové podmínky bez inokulace viru mohou vést k tvorbě exozomů[23], které jsou podobné virionům, rutinně jsme vyšetřili zdravé primární lidské epiteliální buňky
Podrobeny protokolům amplifikace viru. Poté jsme izolovali celkovou RNA z hladovějících nebo kontrolních buněk a supernatantů obsahujících virovou RNA.
Laboratoř instruovaná Lankou striktně dodržovala pokyny protokolu WHO, aby přidala všechny složky buněčné kultury bez možnosti, že by se v kultuře nacházel jakýkoli „virus“.
Materiály a metody Buněčná kultura
Komerční lidské primární epiteliální buňky pasáže 3 byly rozmraženy a expandovány v počtu 4’000 buněk/cm2 v baňkách o ploše 75 cm2 při 37 °C s 5 % CO2 v definovaném epiteliálním médiu s nízkým obsahem vápníku (bez FCS) a 1 x trojnásobným množstvím antibiotik (Gibco) (kontrolní médium, CM).
Při > 80 % konfluenci byly expanzní buňky odděleny pomocí 5 ml enzymu Accutase při 37 °C po dobu 1 O minut. Accutase byla neutralizována 10 ml CM, buňky byly centrifugovány 5 minut při 400 G, resuspendovány v 1 ml CM, živé buňky byly spočítány pomocí barvení trypanovou modří v přístroji Countess II (ThermoFisher).
Buňky byly vyříznuty pro experiment nebo paralelní kola expanze pro následné experimenty. Pro každý experiment byly čtyři skupiny zdravých primárních epiteliálních buněk ze stejného expanzního souboru nasazeny do CM v množství 4000 buněk/cm2 v baňkách o objemu 25 cm2 a kultivovány do >50% konfluence.
Poté bylo médium nahrazeno čtyřmi experimentálními podmínkami; pro kontrolní buňky čerstvým CM (Kontrola 1) nebo komerčním DMEM doplněným GlutaMAXem, 10% tepelně inaktivovaným FCS a 1 x trojnásobným antibiotikem (Kontrola 2).
Potrava byla odebrána náhradou CM za DMEM s 1 % FCS a 3x trojitým antibiotikem, v zásadě podle protokolů pro amplifikaci virionů1 (hladovění 1 a 2). Stresovaná hladová skupina 2 byla navíc ošetřena 1 O μg celkové kvasinkové RNA (yRNA) na kultivační láhev po dobu 1 hodiny a důkladně ošetřena skupinou 1 a 2 před výměnou média promytého fosfátovým pufrem (PBS). Poté byly provedeny dvě slepé pasáže, při nichž bylo 50 % supernatantu z hladových skupin 1 a 2 přeneseno do další buněčné kultury. Supernatanty byly zbaveny mrtvých buněk centrifugací při 400 G po dobu 5 minut. Kontrolní skupiny dostaly 100 % čerstvého média.
Pokusy byly opakovány třikrát ve dvou opakováních. Délka kultury ve stresu definovaná v prvním biologickém opakování byla pro všechny experimenty konstantní. Během stresového období nebyla provedena žádná výměna média.
P4: výměna média u kontrolních a stresovaných buněk při přibližně 50% konfluenci; kontrolní buňky kultivovány do >80% konfluence, stresované buňky kultivovány po dobu 5 dnů po výměně média.
P5: výměna média u kontrolních a stresovaných buněk při >50% konfluenci, kontrolní buňky kultivovány do >80% konfluence, stresované buňky kultivovány po dobu 8 dní po výměně média.
P6/ Izolace RNA: změna média u kontrolních a stresovaných buněk při přibližně 50% konfluenci; kontrolní buňky kultivované do >80% konfluence, stresované buňky kultivované po dobu 5 dnů po změně média. P6/krystalová violeť: změna média u kontrolních a stresovaných buněk při 100% konfluenci; indukce stresu po dobu 3 dnů. Reprezentativní fotografie všech buněčných kultur byla pořízena denně při pokojové teplotě pomocí mikroskopu Nikon Eclipse TS100 s jasným polem, fotoaparátem Nikon 1J5, adaptérem Nikon FT1 a objektivem se 4násobným zvětšením.
Výsledky jsou uvedeny níže. Je jasně vidět, že s rostoucím množstvím antibiotik, odstraňováním živin a časem buňky, které se zřetelně shlukují, odumírají… Cytopatický efekt. Koncentrace těchto materiálů a metod byly všechny provedeny podle standardního postupu WHO.
A zde jsou buňky „fixované a obarvené“ na fialovo. Vypadají sice jinak a je „poznat rozdíl mezi obarvenými a neobarvenými“, ale to nic nemění na tom, že u kontroly došlo k CPE. Tím se dokazuje, že metoda buněčných kultur je podvodná.
Níže je uveden popis výsledků.
Výsledky
Zdravé primární lidské epiteliální buňky byly pěstovány po dobu čtyř pasáží (P3-P6) za optimálních kultivačních podmínek v definovaném kontrolním epiteliálním médiu s 1 x trojnásobným množstvím antibiotik (CM).
Po první pasáži byl buněčný pool rozdělen do čtyř skupin.
Po 3 dnech v CM byly kultury převedeny buď do čerstvého CM (CM, kontrola 1 ), DMEM/GlutaMAX s 10 % FCS, 1 x trojitým antibiotikem (kontrola 2), nebo do stresového média (hladovění 1 a 2).
Během prvního stresového ošetření obsahovalo stresové médium OM EM, 1 % FCS a 3x trojnásobek antibiotik.
Druhá a třetí pasáž byly „slepé“ pasáže, při nichž bylo 50 % kultivačního supernatantu z poslední pasáže převedeno do další pasáže v DMEM, 1 % FCS a 3x trojnásobek antibiotik.
Druhá stresová skupina byla při každé pasáži navíc ošetřena celkovou kvasinkovou RNA (yRNA) po dobu jedné hodiny před přidáním stresového média (hladovění 2).
Po přenesení do DMEM s 10 % FCS nabyly epitelové buňky plošší morfologie než v CM a vytvořily souvislý list buněk, což se přičítá vysoké koncentraci vápníku v DMEM.
Jinak se buňky nadále normálně dělily (obrázek 1 A – viz níže).
Naproti tomu se vrstvy buněk v stresovém médiu zmenšily na malé ostrůvky se sníženým růstem a počínající degenerací buněk. Během dalších dvou pasáží vykazovaly buňky inkubované se supernatantem stresovaných buněk z předchozí pasáže rostoucí CPE s oblastmi bez buněk připomínajícími plaky související s viriony v buněčném listu a více mrtvých buněk plovoucích v supernatantu (obrázek 1 B – viz dále).
Konfluentní kultury ve stresu (obrázek 1 C – viz níže) obarvené krystalovou violetí (obrázek 1 D – viz níže) potvrzují výrazný CPE.
Pyknotické buňky s kondenzovanými jádry nebo balónkovité buňky byly přítomny převážně ve skupině Starvation 1 a oblasti totální destrukce buněk nebo plaků byly pozorovány také ve skupině Starvation 1, ale převážně ve skupině Starvation 2.
Experimenty byly provedeny ve třech biologických opakováních a dvou technických duplikátech. Všechny kultury byly kontrolovány naslepo, přičemž stresované kultury byly snadno identifikovány podle drastických změn morfologie.
Po třech pasážích byla RNA z kontrolní skupiny 1 a obou stresovaných buněčných skupin a supernatantů izolována pomocí souprav pro virovou RNA nebo TRizolu a podrobena sekvenování nové generace. Množství izolované celkové RNA bylo nejhojnější v kontrolní skupině 1 (tabulka 1 – viz níže) a bylo dobré kvality ve všech skupinách (údaje nejsou uvedeny). Další supernatanty byly dále použity pro analýzu extracelulárních částic. Experimenty probíhají.
(ZDE je článek, pojednávající o tomto kontrolním experimentu, přeložený do češtiny, pozn. překl.)
Závěr
Zde je odkaz na článek, kde si můžete přečíst část o kontrolním testu v článku Enders 1954. Tato metoda se dodnes používá téměř ve všech studiích izolace virů… Přestože se ukázalo, že nefunguje, když ji Enders v roce 1954 navrhl, což je vysvětleno v jeho vlastním článku.
Zde je krátké Lankovo video shrnující celou tuto práci.
Tuto práci provedl Jamie Andrews a odkaz na jeho twitterový účet byl uveden v článku. Byla zveřejněna v substacku dpl, ale pod samostatným newsletterem vytvořeným pro Jamieho práci. Zde byla zveřejněna se souhlasem autora.
Další texty ke studiu:
16. února 2016 – Virus podroben soudnímu procesu Zdroj Přeložil: Vladimír Bartoš Úvod Pravděpodobně jednou z nejlepších událostí na téma neexistence virů v nedávné historii byl soudní spor mezi Dr. Stefanem Lankou a Dr. Davidem Bardensem. Jamie si dal značnou práci, aby soudní jednání prohrabal a přeložil ve vlákně na…